ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Физический энциклопедический словарь. - М.: Советская энциклопедия . . 1983 .

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

- см. в ст. Микроскопия.

Физическая энциклопедия. В 5-ти томах. - М.: Советская энциклопедия . Главный редактор А. М. Прохоров . 1988 .

Смотреть что такое "ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ" в других словарях:

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ - микроскопия, основанная на способности разных компонентов клеток и тканей преломлять поляризованные лучи. В поляризационном микроскопе можно исследовать объекты, которым свойственно двойное лучепреломление … Словарь ботанических терминов

Совокупность методов (и обеспечивающих эти методы устройств), предназначенных для наблюдения и изучения под микроскопом объектов, изменяющих в каком либо отношении поляризацию света (См. Поляризация света), который проходит через объекты… …

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ - см. Микроскоп, Микроскопическая техника … Ветеринарный энциклопедический словарь

Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

М. при освещении объекта поляризованным светом; применяется для обнаружения и изучения объектов или их структур, обладающих свойствами двойного лучепреломления … Большой медицинский словарь

Термин сканирующая зондовая микроскопия Термин на английском scanning probe microscopy Синонимы Аббревиатуры СЗМ, SPM Связанные термины "умные" материалы, атомно силовая микроскопия, манипуляция атомами, кантилевер, микроскоп,… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

Способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет… … Медицинская энциклопедия

- (от греч. ἱστός ткань и греч. λόγος знание, слово, наука) раздел биологии, изучающий строение тканей живых организмов. Обычно это делается рассечением тканей на тонкие слои и с помощью микротома. В отличие от анатомии,… … Википедия

Микроскоп (от микро... и греч. skopéo смотрю), оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом. Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую… … Большая советская энциклопедия

I Микроскоп (от Микро... и греч. skopéo смотрю) оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом. Человеческий глаз представляет собой естественную… … Большая советская энциклопедия

Книги

• Введение в количественную цитохимию , . Сводка по количественным методам исследования клетки и применяемой для этого оптической аппаратуре. Основное внимание в книге уделено наиболее надежным методам количественного определения…

Глоссарий:

• Поляризованный свет - это световые волны, колебания которых распространяются в одном направлении.

• Световая волна - это электрическое и магнитное излучение с плоскостью колебания перпендикулярной плоскости распространения волны.
• Поляризатор (николь I) - это устройство, пропускающее через себя только полностью или частично поляризованный свет. Предназначен для пропускания поляризованного света на(через) исследуемый прозрачный объект и отсекание(рассеивание) неполяризованного (естественного света, искусственного света, в т.ч. излучения осветителя микроскопа). Интенсивность света прошедшего через поляризатор падает пропорционально квадрату косинуса угла между плоскостями поляризации поляризатора и анализатора (закон Малюса):

Где: I - интенсивность до прохождения через поляризатор, I - интенсивность света после прохождения поляризатора, φ - угол между плоскостями поляризации поляризованного света и поляризатора.

• Анализатор (николь II) - устройство, аналогичное поляризатору, но предназначенное для анализа поляризованного света.

Поворот анализатора относительно поляризатора на угол ϕ. Интенсивность света показана красной стрелкой.

• Компенсатор - это устройство для определения количественных характеристик поляризации. Преобразует контрастное видимое изображение в цветное, так как гасит определённые длины волн в белом свете.
• Линейно поляризованный свет - это свет с плоскостью колебания, ограниченной в одном направлении, и распространяющийся в одной плоскости.
• Фаза колебаний световой волны, с математической точки зрения, это аргумент функции световой волны, то есть ωt+φ 0 в функции sin(ωt+φ 0). С физической, это определённое электромагнитное состояние в определённый момент времени.

• Длина волны – расстояние между двумя ближайшими точками, находящимися в одной фазе.

• Отражение - это изменение направления волны. Полным отражением называют изменение угла преломления волны менее 90°.

• Преломление - это изменение направления волны на границе двух сред. Двойное лучепреломление – это расщепление одного луча света в анизотропной среде на две луча.

Рисунок 4 – Преломление лучей в кристалле исландского шпата.

• Дихроизм - это частичное поглощение веществом света, в зависимости от его поляризации.

• Интерференция – это изменение интенсивности света при наложении двух или более световых волн.

• Разность хода световых лучей – это величина, характеризующая замедление скорости света, при прохождении через прозрачное вещество. Измеряется разность хода расстоянием проходимое светом в вакууме за то же время, которое необходимо для прохождения в исследуемом веществе, в исследуемых точках пространства.

• Коноскопия – это метод изучения оптических свойств анизотропных объектов в сходящихся лучах поляризованного света. При коноскопии ведётся наблюдения за изменением интерференционной картины при повороте анализатора. Вращая анализатор и поляризатор, друг относительно друга, исследователь наблюдает в микроскоп коноскопические фигуры, состоящие из изогир (это тёмные полосы, соответствующие направлению колебаний световых волн в поляризаторе) и изохром (это полосы разных интерференционных цветов, которые соответствуют направлениям движения лучей в кристалле с одинаковой разностью хода).

• Ортоскопия – это метод изучения оптических свойств анизотропных объектов в параллельных лучах поляризованного света.

• Плеохроизм – изменение наблюдаемой окраски некоторых анизотропных объектов при изменении угла наблюдения (изменение цвета кристаллов при повороте столика).

Поляризационный микроскоп - это микроскоп, предназначенный для исследования двойного лучепреломления поляризованного света, проходящего через анизотропную среду

Первый поляризационный микроскоп был сконструирован в 1863 году Генри Клифтоном Сорби и отличался от привычного нам оптического микроскопа, двумя призмами Николя, установленными в оптическом пути. Призма Николя пропускает через себя свет только в одном направлении и в одной плоскости, то есть плоско поляризованный свет, остальной свет, попавший в эти призмы полностью отражается и рассеивается. Эти призмы конструктивно ничем друг от друга не отличаются и выполняют роль поляризаторов (анализатора и поляризатора). Когда плоскость поляризации анализатора повёрнута на 90º, относительно плоскости поляризации поляризатора, исследователь наблюдает поляризационную картину двулучепреломляющего объекта, а все объекты, не обладающие двойным лучепреломлением - затемнены. В современных микроскопах, для получения большего количества информации могут использоваться ДИК призмы (совмещение рельефа с поляризационной картиной, для изучения неокрашенных образцов), компенсаторы (для количественной поляризации), круглый столик (для изучения плеохроизма) и простые поляроиды для несложных наблюдений (например в биологии и медицине).

Наиболее часто поляризация применяется в икроскопах для кристалографии, где свойства анизотропных объектов могут быть определены с помощью коноскопии и ортоскопии. Обратите внимание на сходство и различие коноскопии и ортоскопии: световой пучок, проходит через поляризатор (1), ограничивается апертурной диафрагмой (2), проходит через линзы конденсора (3); анализатор (который поворачивает исследователь) (8) и компенсаторы (7).

Рисунок 1 – Схема поляризационного микроскопа при: а) Ортоскопии б) Коноскопии

Условные обозначения: 1 - поляризатор, 2,6 - диафрагмы; 3 - конденсор; 4 - препарат; 5 - объектив; 7 - компенсатор; 8 - анализатор; 9 - линза Бертрана; 10 - фокальная плоскость окуляра; 11 - окуляр.

Наблюдаемая картина состоит из коноскопических фигур. коноскопические фигуры – состоят из изогир (это тёмные прямые или изогнутые полосы, в которых направления колебаний параллельны главным сечениям николей) и изохром (это полосы, окрашенные в различные интерференционные цвета. Каждая полоса соответствует направлениям лучей, образовавшихся при двулучепреломлении, и имеющим одинаковую разность хода).

Приведём пример: в пластинках одноосного кристалла, вырезанного перпендикулярно оптической оси, мы увидим изогиру в форме креста и концентрические кольца изохромы см. рис. 5.

Рисунок 5 – А) Коноскопические фигуры одноосного минерала кальцита Б) Двуосного минерала флогопита со вставленным компенсатором.

По характеру полученной интерференционной картины проводится измерение величины двойного лучепреломления, углов поворота плоскости поляризации, углов погасания, определение количества оптических осей и других характеристик. Все эти характеристики дают понять какой кристалл наблюдает исследователь, его строение. Для минералогии и кристаллографии сконструированы такие микроскопы как BX53P и H600P. Они оснащаются лучшей оптикой, свободной от напряжений и компенсаторами, изготовленными на современном оборудовании, исключающим люфт и зазоры при их установки в микроскоп.

Двулучепреломление применяется не только в кристаллографии, но и в медицине, биологии, криминалистике и металлографии, потому как исследователям важно быстро и точно выделять витамины, кислоты, минералы, напряжения в изотропных объектах, неметаллические включения в исходном образце и другие. Например, микроскопы для гистологии и цитологии оснащаются поляризаторами для выявления разного рода объектов. Круглые объекты с диаметром около 2,4 мкм, липоиды и капли, при скрещенных поляризаторах образуют интерференционную картину мальтийский крест. Не все вещества обладают одинаковыми свойствами лучепреломления при разных температурах, так, например, можно выделить 1) вещества приобретающие анизатропные свойства при охлаждении и теряющие их при нагревании: холестерин и его эфиры 2) не теряющие своих анизатропных свойств при нагревании: цереброзиды, фосфатиды, миелины. Такая изменчивость свойств обусловлена способностью вещества поддерживать кристаллическую структуру, т.к. именно она обуславливает двулучепреломление. Наблюдая анизатропные объекты в поляризационном микроскопе и определяя их концентрацию, можно диагностировать такие заболевания как: артрит, атеросклероз, липоидурия, цилинурия и липидоз по свечению липидов при скрещенных поляризаторах, а также подагру, мочекаменную болезнь, селикоз и асбестос по кристаллам мочевины, двуокиси кремния и асбестовым волокнам соответственно. Для гистологии и цитологии разработан микроскоп BX46, который оснащён низким столиком, мощным осветителем и регулируемый по высоте тубус, который избавит спину исследователя от затекания.

Окраску отличную от изотропных объектов, в поляризованном свете имеют: крахмал, целлюлоза, некоторые кислоты, витамин С, поэтому микроскопы для фармакологии и фармацевтики так же должны оснащаться поляризаторами. Фармакологический микроскоп, это и CX43, и BX43, и другие модели, потому что исследований в этой области с каждым годом всё больше,а новые объекты исследований требуют иного подхода.

В криминалистике важно отличить вкрапления зёрен кварца и других минералов от органики и других материалов, которые можно найти на месте преступления, поэтому микроскоп должен обязательно быть оснащён отражённым светом, чтобы рассматривать и непрозрачные объекты. Для криминалистики подойдёт микроскоп BX53M , так как он оснащается не только мощным источником проходящего света, но и таким же мощным осветителем отражённого света, а провставки для увеличения рабочего расстояния микроскопа, позволят проводить исследования очень больших объектов не проводя долгой предварительной подготовки.

В металлографии тоже применяются поляризационные микроскопы, но для подобных исследований достаточно знать наличие или отсутствие анизатропных объектов, а так же их пространственное распределение. Именно для классификации и подсчёта таких объектов, в металлографии можно использовать микроскопы VHX6000, BX53P с установленным Stream.

Поляризационная микроскопия — один из высокоэффективных методов морфологического исследования, обладающий широкими возможностями идентификации биологических структур, что в сочетании с доступностью и относительной простотой обусловливает его высокую ценность. Метод позволяет изучать не только гистологическое строение препарата, но и некоторые его гистохимические параметры. В 40 —50-х годах XX в. поляризационную микроскопию причисляли к ультраструктурным методам, так как она позволяла видеть ультраструктурные способности тканей.

Поляризационная микроскопия предназначена для изучения свойств гистологических структур, обладающих способностью двоякого лучепреломления (анизотропии) — раздвоения светового луча при прохождении его через анизотропную среду. Световая волна в анизотропной среде распадается на две волны с взаимно перпендикулярными плоскостями колебаний электромагнитных волн. Эти плоскости называются плоскостями поляризации. Поляризованный свет отличается от обычного (неполяризованного) тем, что в последнем колебания световых волн происходят в различных плоскостях, а в поляризованном свете — лишь в определенной плоскости.

Для создания эффекта поляризации в поляризационном микроскопе применяются два поляроида. Первый, который называется поляризатором, помещается между осветителем микроскопа и гистологическим препаратом.Второй поляроид, находящийся между гистологическим препаратом и глазом исследователя, — анализатором. И поляризатор, и анализатор в оптическом отношении представляют собой совершенно одинаковые поляризационные фильтры, поэтому их можно менять местами (если конструкция микроскопа это позволяет). Ранее для поляризационной микроскопии применяли изготавливаемые из исландского шпата призмы Николя, Аренса или Томсона. У этих призм был ограничен угол преломления света. В настоящее время вместо них используют плоские поляризационные фильтры, продуцирующие широкопольный поляризованный свет.

В создании поляризованного света определяющую роль играет взаимное расположение поляризатора и анализатора относительно оптической оси микроскопа. Если они ориентированы таким образом, что тот и другой пропускают поляризованный свет в одной и той же плоскости, т.е. при совпадении их плоскостей поляризации, оба поляризационных фильтра способны пропускать поляризованный свет; поле зрения микроскопа при этом светлое (рис. 1,а).

Рис. 1 Препарат легкого человека в светлом поле, OlympusCX41 , объектив 10х

Если же плоскости поляризации поляризационных фильтров взаимно перпендикулярны (этого достигают путем поворота анализатора на 90° вокруг оптической оси микроскопа), то поляризованный свет не проходит и исследователь видит темное поле зрения (рис. 2).

При повороте поляризатора на 360° в процессе его вращения поле зрения дважды полностью затемнено и дважды полностью просветлено. В прошлом применяли компенсаторные фильтры Бернауэра, при использовании которых затемненное поле зрения имеет красноватый оттенок (U-TP530 ). При применении черных зеркальных фильтров затемненное поле зрения выглядит не полностью темным, а слабо подсвеченным.

Рис.2 Препарат легкого человека в поляризованном свете, объектив 10х

В тех случаях, когда при скрещенном положении поляризационных фильтров (т.е. в ортоскопии) на пути поляризованного света встречаются анизотропные субстанции, содержащиеся в гистологическом препарате, эти субстанции расщепляют поляризованный свет на два луча с взаимно перпендикулярными плоскостями колебаний световых волн. Световые лучи с плоскостью колебаний, совпадающей с плоскостью поляризации, проходят через анализатор, а с перпендикулярной — отсекаются, вследствие чего интенсивность светового потока, попадающего в глаз исследователя и на камеру, составляет лишь половину интенсивности исходного светового пучка. В результате описанных процессов анизотропные субстанции, находящиеся между двумя скрещенными поляризаторами, видны на темном фоне в виде светлых светящихся объектов. При этом изотропные структуры, не обладающие способностью двоякого лучепреломления, остаются темными.

Это также влияет на выбор камеры для поляризационной микроскопии . Так как задача стоит снять небольшие светлые сигналы на темном фоне, то обычно камеры для светлопольной микроскопии может быть недостаточно, из-за низкой чувствительности камеры и большого количества шумов, которые образуются при съемке. Для съемки в поляризационной микроскопии необходима камера для микроскопии с высокой чувствительностью и точной цветопередачей . Предпочтительно использовать камеры на базе CCD- матриц ( , VZ-CC50S), однако на текущем этапе можно применять и бюджетные варианты камер на базе CMOS-матриц Sonyсерии IMX ().

В биологических тканях имеется достаточное количество анизотропных структур: элементы сократительного аппарата мышц, амилоид, мочевая кислота, коллагеновые образования, некоторые липиды, ряд кристаллов и др.

Расщепленные в анизотропном объекте и проходящие через анализатор световые лучи характеризуются неодинаковой скоростью распространения волн. В зависимости от величины этой разницы (ее еще называют величиной задержки светового луча ) и от различий абсорбции света в анализаторе свечение анизотропных объектов может быть белым или цветным. В последнем случае речь идет о феномене дихроизма (двойная абсорбци я). Цветовые эффекты при исследовании в поле поляризации дают, например, многие кристаллы.

Процесс двоякого лучепреломления может быть усилен путем применения определенных красителей, молекулы которых обладают способностью ориентированно откладываться на анизотропных структурах. Гистохимические реакции, в результате которых возникает эффект анизотропии, называются топооптическими реакциями (G. Romhanyi). Различают две разновидности таких реакций — аддитивные и инверсивные. При аддитивных реакциях задержка светового луча увеличивается, что называют положительной анизотропией, при инверсивных реакциях она уменьшается — отрицательная анизотропия.

АППАРАТУРА И ОБОРУДОВАНИЕ

Поляризационную микроскопию проводят с помощью специальных поляризационных микроскопов. В качестве примера можно назвать импортные микроскопы , . Большинство современных оптических микроскопов оснащаются принадлежностями для поляризационной микроскопии.

Для поляризационной микроскопии можно приспособить любой световой микроскоп лабораторного и исследовательского класса. Достаточно иметь два поляризационных фильтра, один из которых, выполняющий функцию поляризатора, помещают между источником света и препаратом, а другой, играющий роль анализатора,— между препаратом и глазом исследователя. Поляризатор может быть встроен в конденсор или же размещен под ним над полевой диафрагмой, а анализатор — в слот револьвера или же промежуточную вставку.

На рис. 3 представлена принципиальная схема поляризационного микроскопа. Помимо общих для всех световых микроскопов компонентов, в поляризационном микроскопе имеется два поляризационных фильтра (поляризатор, размещаемый обычно под конденсором, и анализатор, находящийся в окуляре), а также компенсатор. Анализатор должен обязательно вращаться, причем для определения степени вращения необходима соответствующая градуированная шкала.

В поляризационном микроскопе используется источник освещения, обеспечивающий высокую плотность светового пучка. В качестве такого источника рекомендуют применять лампу мощностью 100 Вт при напряжении 12 В. Для некоторых видов исследования требуется монохроматический свет. С этой целью используют металлический интерференционный фильтр, который лучше поместить над зеркалом . Рассеивающее свет матовое стекло помещают перед поляризатором, т.е. между ним и источником освещения, но ни в коем случае не после поляризатора, так как при этом нарушается функция поляризационного фильтра.

Раньше для поляризационной микроскопии применялись ахроматические объективы без внутренних натяжений, однако сейчас они редкость. На сегодняшний день в поляризационном микроскопе используют только планахроматические объективы, которые не имеют внутренних натяжений. Апохроматические объективы можно применять лишь в тех случаях, когда требуется нормальная цветопередача при микрофотографировании .

Поляризационные микроскопы оснащаются вращающимся предметным столиком, положение которого относительно оптической оси можно менять. Угол поворота столика измеряют с помощью градусной шкалы, нанесенной по его окружности. Одним из обязательных условий, обеспечивающих эффективное применение поляризационной микроскопии, является тщательная центровка вращающегося предметного столика с помощью центровочных винтов.

Важным элементом поляризационного микроскопа является компенсатор, помещаемый между объективом и анализатором, обычно в тубусе микроскопа. Компенсатор представляет собой пластинку, изготавливаемую из особых сортов гипса, кварца или слюды. Он позволяет измерять разницу хода расщепленных световых лучей, выражающуюся в нанометрах. Функционирование компенсатора обеспечивается его способностью изменять разницу хода световых лучей, низводя ее до нуля либо увеличивая до максимума. Это достигается вращением компенсатора вокруг оптической оси.

МЕТОДИКА МИКРОСКОПИИ В ПОЛЯРИЗОВАННОМ СВЕТЕ

Поляризационную микроскопию удобнее проводить в затемненном помещении, так как интенсивность светового потока, попадающего в глаз исследователя, уменьшается в 2 раза по сравнению с исходной. После включения осветителя микроскопа вначале добиваются максимально яркого освещения поля зрения путем вращения поляризатора или анализатора. Такое положение поляризационных фильтров соответствует совпадению их плоскостей поляризации. Препарат помещают на предметный столик и изучают его сначала в светлом поле. Затем путем вращения поляризатора (или анализатора) максимально затемняют поле зрения; эта позиция фильтра соответствует перпендикулярному расположению плоскостей поляризации. Для того чтобы выявить эффект анизотропии, нужно совместить плоскость поляризации анизотропного объекта с плоскостью поляризованного света. Эмпирически этого добиваются путем вращения предметного столика вокруг оптической оси. Если для поляризационной микроскопии используют световой микроскоп, не оборудованный вращающимся столиком, то приходится вращать гистологический препарат вручную. Это допустимо, однако в таком случае нельзя проводить отдельные виды поляризационной микроскопии, требующие количественной оценки (определение знака двоякого лучепреломления, величины разницы хода световых лучей).

Если анизотропные объекты в исследуемом препарате расположены упорядоченно (например, анизотропные диски поперечнополосатых мышечных волокон), их удобно изучать в фиксированном положении предметного столика, при котором эти объекты дают максимальное свечение на темном фоне. Если же анизотропные структуры располагаются в препарате хаотично (например, кристаллы), то при их исследовании приходится постоянно вращать предметный столик, добиваясь свечения той или иной группы объектов.

Для проведения более углубленного анализа и оценки топооптических реакций необходимо знать методику определения относительного знака двоякого лучепреломления, величины разницы хода лучей и индекса (коэффициента) лучепреломления.

Знак двоякого лучепреломления характеризует степень и направление смещения хода световых лучей, проходящих через анализатор. Это смещение вызывается топооптическими красителями, и в том случае, если оно направлено в сторону уменьшения разницы хода лучей, говорят об отрицательном знаке двоякого лучепреломления (отрицательная анизотропия ), если же оно способствует увеличению разницы хода лучей, то констатируют положительный знак двоякого лучепреломления (положительная анизотропия ). Если разница хода лучей исчезает, то эффект анизотропии нивелируется.

Знак двоякого лучепреломления определяют с помощью компенсатора. Процедура его применения заключается в следующем. Исследуемый объект помещают в положение, при котором в темном поле зрения достигается максимальное свечение анизотропных структур. Пластинку RI-компенсатора поворачивают вокруг оптической оси под углом +45° по отношению к плоскости поляризации анализатора. Объект в зависимости от разницы хода световых лучей, которая может колебаться от 20 до 200 нм, приобретает либо голубую, либо желтую окраску. В первом случае знак двоякого лучепреломления положительный, во втором — отрицательный. Следует иметь в виду, что в том случае, когда компенсатор расположен под углом +45°, общий фон затемненного поля зрения имеет красный оттенок.

Можно использовать также компенсатор λ/4 (U-TP137). Процедура его применения такая же, только поле зрения имеет не красный, а серый оттенок, и объект при положительном знаке лучепреломления светится, а при отрицательном — затемнен.

Количественное определение разницы хода световых лучей, выражаемой в нанометрах, осуществляют с помощью компенсатора Брака Келера. Для этого используют формулу:

Γ=Γλ×sinφ

где λ — константа, проставляемая на компенсаторе заводом-изготовителем, φ — угол поворота компенсатора относительно плоскости поляризации анализатора.

Индекс лучепреломления анизотропного объекта определяют путем его сопоставления (под микроскопом) с тест-объектом, помещаемым рядом. В качестве тест-объектов используют стандартные жидкости с известным индексом лучепреломления. Объект и образец помещают рядом на предметном столике. При несовпадении их коэффициентов преломления между объектом и образцом видна светлая линия, называемая линией Бека. Подъем тубуса микроскопа относительно сфокусированного положения вызывает смещение линии Бека в сторону среды, дающей более выраженный эффект лучепреломления. При совпадении коэффициентов лучепреломления объекта и образца линия Бека исчезает. Обычно коэффициент лучепреломления определяют в монохроматическом свете для натриевой линии спектра (при длине волны 589 нм и температуре 20 °С). Лучепреломление cледует определять для двух взаимно перпендикулярных плоскостей поляризации. С этой целью снимают анализатор и регистрируют лучепреломление объекта в его двух взаимно перпендикулярных положениях. Разница между обоими показателями лучепреломления (ng — nk) характеризует силу лучепреломления.

ОСОБЕННОСТИ ОБРАБОТКИ МАТЕРИАЛА И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ

Фиксация материала для поляризационной микроскопии в кислом формалине нежелательна, так как формалиновый пигмент, образующийся при взаимодействии гемоглобина тканей с кислым формальдегидом, обладает анизотропными свойствами и затрудняет изучение препаратов в поляризованном свете. G. Scheuner и J. Hutschenreiter (1972) рекомендуют использовать с этой целью 10 % нейтральный формалин, раствор кальций-формола по Бейкеру, жидкость Карнуа.

Продолжительность фиксации в 10 % нейтральном формалине 24 — 72 ч при 4 °С, в растворе кальций-формола по Бейкеру — 16 — 24 ч при 4 °С. Фиксация в кальций-формоле особенно предпочтительна при исследовании липидно-белковых соединений. Жидкость Карнуа быстро пропитывает ткани. Кусочки толщиной 1 — 2 мм бывают профилированы уже через 1 ч при температуре 4 °С. Для исследования липидов фиксация в жидкости Карнуа непригодна. Кроме того, применяют жидкость Ценкера, особенно при импрегнации солями золота и серебра. После обработки смесью жидкости Ценкера и уксусной кислоты эритроциты приобретают способность к двоякому лучепреломлению.

При исследовании в поляризационном микроскопе плотных тканей (кости, зубы), помимо кислотной декальцинации, необходима дополнительная обработка для удаления коллагеновых волокон. С этой целью шлифы таких тканей в течение нескольких минут варят в смеси глицерина и гидроксида калия (10 мл глицерина и 2 крупинки гидроксида калия) до полного побеления, затем осторожно сливают щелочь, шлиф промывают в воде и переносят с помощью пинцета на предметный столик микроскопа.

Для поляризационной микроскопии используют парафиновые, замороженные и криостатные срезы. Неокрашенные замороженные срезы для изучения в поляризованном свете заключают в глицерин. Нефиксированные криостатные срезы пригодны для поляризационно-микроскопического анализа сразу после приготовления. В связи с их высокой чувствительностью к повреждающему действию различных факторов внешней среды эти срезы все же рекомендуют фиксировать в 10 % нейтральном формалине или растворе кальций-формола.

На результаты поляризационной микроскопии оказывает влияние толщина гистологических срезов. При исследовании толстых срезов создаются условия для наложения разных анизотропных структур друг на друга. Кроме того, при разной толщине срезов могут меняться анизотропные свойства изучаемых структур, поэтому очень важно, особенно при сравнительных исследованиях, обеспечивать постоянную толщину срезов. Рекомендуемая максимальная толщина срезов не должна превышать 10 мкм.

Еще одним обязательным условием является тщательное депарафинирование срезов, так как не удалённые остатки парафина дают выраженный эффект анизотропии, затрудняя исследование. Парафин особенно долго задерживается на эритроцитах и ядрах клеток. Для того чтобы полностью удалить парафин из срезов, рекомендуют провести их следующую обработку.

• Ксилол 30 мин
• Спирт 100% 5 мин
• Смесь метанола и хлороформа (1:1) при 50 °С 24 ч
• Спирт 100 % 5 мин
• Спирт 70 % 10 мин Вода

Следует также иметь в виду, что срезы, которые подвергают поляризационной микроскопии, не должны вступать в контакт с фенолами (например, их нельзя просветлять в карбол-ксилоле).

Более подробную информацию по поляризационной микроскопии и применении компенсаторов можно получить по ссылке (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).

Если у Вас возникли вопросы по поляризационной микроскопии, обратитесь в Школу микроскопии.

Метод фазово-контрастной микроскопии

Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность(с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия)

Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой -- мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

Оглавление темы "Методы выделения бактерий. Микроскопия. Питательные среды для культивирования бактерий.":

Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Рис. 11-4. Схема люминесцентного микроскопа .

Интерференционная микроскопия

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой - мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.

Рис. 11-5. Прямая иммунофлюоресценция . Прямой метод предполагает использование помеченных флюоресцирующим красителем AT к интересующему Аг; AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации, что и позволяет визуализировать метка.

Люминесцентная микроскопия

Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.

Рис. 11-6. Непрямая иммунофлюоресценция . Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг микроорганизма, вторые AT (связанные с меткой) специфически взаимодействуют с первыми AT, являющимися Аг ко вторым AT. Метод значительно чувствительнее, чем прямая иммунофлюоресценция, так как с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT.

Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11-5 и 11-6.